Etudes Structurales et Fonctionnelles de l'Acide Laurique et des Protéines Lipase B de Candida Antarctica (CALB), de la Neuropiline-1 (Nrp-1).

Abstract

Cette thèse porte sur les Études Structurales et Fonctionnelles des Protéines Lipase B de Candida Antarctica (CALB), de la Neuropiline-1 (Nrp-1) et de l'Acide Laurique. Un des premiers objectifs de cette thèse était d'améliorer la solubilité de l'acide bétulinique (BTA) dans l'eau en modifiant sa fonction alcoolique par une réaction de couplage pseudo- peptidique avec le 2-chlorocinnamoyl et le chlorure de phénoxyacétyle. Parallèlement, cette thèse s'est penchée sur la recherche de cocristaux d'acide laurique et de lysine. Des cristaux de laurate de sodium, acide laurique (NaLLA) ont été obtenus et la structure a été résolue grâce à la diffraction des rayons X sur monocristal. Ces données ont permis d'étudier les interactions atomiques en utilisant l'approche de la surface de Hirshfeld et l’enrichissement des contacts. Ensuite, cette thèse s'est réorientée vers le domaine de la cristallographie des protéines. Au cours de cette réorientation, deux protéines ont été soumises à une étude approfondie. Dans un premier volet, une attention particulière a été portée à la lipase B de Candida Antarctica (CALB), une enzyme présentant des propriétés énantiosélectives intéressantes pour la production de molécules par biocatalyse. Une cocristallisation de la CALB en présence de la lysine a été entreprise pour mieux comprendre les mécanismes de fixation de cette dernière sur le site actif de la protéine. Les cristaux obtenus ont été caractérisés par la diffraction des rayons X et la structure a été résolue par la méthode du remplacement moléculaire. Il s'est avéré que les cristaux présentent une macle avec une loi de type (h,-k,-l). La seconde protéine d'intérêt était la Neuropiline-1, souvent abrégée Nrp-1, une protéine humaine transmembranaire. Elle est composée de plusieurs domaines, dont un domaine extracellulaire impliqué dans la liaison à certains ligands, et un domaine intracellulaire participant à la signalisation cellulaire. Nrp-1 interagit avec plusieurs facteurs de croissance et molécules de signalisation, tels que les sémaphorines de classe 3 (Sema 3, notamment Sema3A) et le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), pour réguler la croissance des neurones En plus de son rôle dans le système nerveux, la Neuropiline-1 est également impliquée dans la régulation de la croissance des vaisseaux sanguins (angiogenèse) et d'autres processus physiologiques. Le Nrp-1 est une cible thérapeutique potentielle car elle est supposée jouer un rôle dans le développement de certains cancers en facilitant la vascularisation tumorale. L'étude cristallographique a été réalisée sur le fragment b1 de Nrp-1 car ce fragment est soluble dans l’eau et renferme le site de liaison du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Dans les cristaux de la forme native de Nrp1-b1, ce site de liaison est obstrué par l'empilement cristallin. Il n'est donc pas possible d'utiliser les cristaux de la forme native pour tester des inhibiteurs ciblant le site de liaison du VEGF. Dans le but d’obtenir une autre forme cristalline, des mutations ont été introduites au niveau des acides aminés chargés situés à la surface de la protéine. Cela a permis la formation d'un nouvel empilement cristallin, laissant accessible le site de liaison du VEGF. Dans une perspective plus analytique, le variant a été co-cristallisé avec le peptide de séquence primaire KDKPPR. Les interactions atomiques ont été minutieusement analysées en utilisant de nouvelles approches basées sur des modèles de densité électronique multipolaire. Pour approfondir l'analyse, des simulations de dynamique moléculaire ont été mises en œuvre, permettant de comparer la dynamique du variant à celle de la forme native, ainsi qu'à celle des formes libres et en complexe avec le peptide KDKPPR.